Żeby wyjść poza starsze kohorty mikrobiomu, musieliśmy zbudować most

W pierwszej pracy z tej serii zadaliśmy wąskie pytanie. Jeśli zostaniemy w ściśle porównywalnej grupie badań diety i mikrobiomu w stylu 16S/MaAsLin, to czy opublikowane tabele współczynników są na tyle zgodne, żeby można je było odpowiedzialnie wykorzystać ponownie?

Odpowiedź brzmiała: tak, a zgodność była na tyle duża, że uzasadniała zbudowanie warstwy odniesienia.

To rozwiązało jednak tylko pierwszy problem.

Duża część najcenniejszej nowszej literatury o mikrobiomie nie mieści się już w tej starszej przestrzeni współczynników 16S. Duże nowe kohorty korzystają z metagenomiki shotgun, transformacji CLR (centered log-ratio) i innych procedur statystycznych. Często obejmują szerszy zakres cech badanych osób, lepsze dane o lekach i zmienne bliższe danym klinicznym. Tyle że przez to nie da się ich już naiwnie porównywać ze starszymi.

Następne pytanie było więc oczywiste. Czy wybrane nowsze kohorty da się włączyć do tego samego programu badawczego bez udawania, że wszystkie opublikowane współczynniki są z natury wymienne?

W tym wpisie streszczamy drugą pracę, w której szukamy właśnie takiego mostu.

Dlaczego potrzebna była druga praca

Po pierwszej pracy mieliśmy zweryfikowaną warstwę odniesienia 16S, zbudowaną z trzech kohort:

• LifeLines-DEEP
• Flemish Gut Flora Project
• American Gut Project, przeliczony od nowa do porównywalnego formatu

Ta warstwa była przydatna, ale niepełna. Obejmowała tylko wąski wycinek publicznych dowodów. Wiele większych i nowocześniejszych kohort, które dziś nadają ton tej dziedzinie, korzysta z innych technologii sekwencjonowania i innych przekształceń danych o liczebności bakterii. Takie badania często dodają dokładnie te zmienne, których potrzebuje szersza warstwa dowodów: przyjmowane leki, klinicznie uporządkowane cechy badanych osób, profile objawów i bogatsze metadane powiązane z dokumentacją medyczną.

Krótko mówiąc, baza dowodów rosła szybciej niż ta jej część, którą dało się porównywać.

Dlatego powstała druga praca. Nie twierdzimy w niej, że starsze i nowsze kohorty nagle stały się równoważne. Pytamy, czy część nowszych kohort da się połączyć ze zweryfikowaną warstwą odniesienia przez jawny krok kalibracji.

Problem: przyporządkowanie to jeszcze nie walidacja

Łatwo przecenić, co oznacza harmonizacja.

Można przyporządkować do siebie czynniki z różnych kohort pod względem znaczenia, a współczynniki i tak będą pochodzić z przestrzeni, których nie da się wprost porównać. Zmienna może pasować pojęciowo, a podana wielkość efektu może pochodzić z innej przestrzeni transformacji. Gdy jedna kohorta podaje współczynniki 16S po transformacji arcsinus pierwiastka, a druga współczynniki shotgun oparte na CLR, porównywanie surowych wielkości przestaje być wiarygodne.

Szerszy zharmonizowany panel daje więc dwa bardzo różne rodzaje postępu:

• przyporządkowany zasięg, gdy więcej czynników i taksonów trafia do wspólnych ram
• zweryfikowaną część wspólną, gdy wspólne obserwacje są na tyle mocne, żeby naprawdę porównywać kohorty między sobą

Druga praca dotyczy przede wszystkim tego, żeby tych dwóch rzeczy nie mieszać.

Co dodaliśmy

Rozszerzyliśmy panel z trzech do pięciu kohort, dodając dwa badania oparte na shotgun i CLR:

• Dutch Microbiome Project (DMP): 8208 uczestników, szeroki zakres cech, obszerne dane o lekach
• Estonian Microbiome Project (EstMB): 2509 uczestników, niezależna kohorta z inną procedurą opartą na CLR

To rozszerzenie wyraźnie zmieniło mapę dowodów. Szczególnie poszerzyło zasięg w takich obszarach jak:

• leki
• klinicznie uporządkowane czynniki
• objawy ze strony przewodu pokarmowego
• zmienne dotyczące zdrowia psychicznego
• czynniki z wczesnego dzieciństwa i dane powiązane z dokumentacją medyczną

To przydatne. Ale przez to problemu porównywalności nie da się już zignorować. Więcej przyporządkowanych czynników nie znaczy jeszcze, że współczynniki da się wiarygodniej wykorzystać.

Pomysł na most: kalibracja na punktach zakotwiczenia

Nasze rozwiązanie w tej pracy nazywamy empiryczną kalibracją na punktach zakotwiczenia.

Pomysł jest prosty. Jeśli nowsza kohorta docelowa i zweryfikowana kohorta odniesienia mają część wspólnych związków między czynnikiem a taksonem i te wspólne pary zgadzają się co do kierunku, to można ich użyć jako punktów zakotwiczenia. Najczystsze są predyktory binarne, bo zmniejszają ryzyko, że stosunek współczynników wynika z różnic w skali predyktorów, a nie z samej transformacji liczebności.

Zamiast więc traktować współczynniki oparte na CLR tak, jakby leżały na tej samej skali co warstwa odniesienia 16S, sprawdziliśmy, czy wspólne binarne punkty zakotwiczenia pozwalają oszacować empiryczny most z powrotem do tej przestrzeni odniesienia.

To twierdzenie dużo skromniejsze niż „wszystko da się porównać ze wszystkim”. I dużo łatwiej go bronić.

Co wyszło

Najmocniejszy most w tej pracy to DMP w porównaniu z Zhernakovą 2016.

To najczystsze dostępne porównanie między metodami w obecnym panelu, bo obie kohorty wywodzą się z szerszego środowiska LifeLines. Wspólne pochodzenie każe zachować metodologiczną ostrożność, ale właśnie dlatego to najlepsze miejsce, żeby sprawdzić, czy kohortę odniesienia 16S da się połączyć z nowoczesną kohortą shotgun/CLR bez całkowitego rozpadu zgodności.

Wynik był zachęcający:

• 100% zgodności znaku na poziomie gatunku w 12 wspólnych istotnych parach
• 74,2% zgodności znaku na poziomie rodzaju w 31 wspólnych istotnych obserwacjach
• dodatnia korelacja rang na poziomie rodzaju ($\rho$ = +0,416)

Podzbiór binarnych punktów zakotwiczenia w tym moście dał zwarte skupisko o wysokiej pewności wokół współczynnika skali 0,165 dla DMP względem przestrzeni odniesienia 16S.

Nie znaczy to, że DMP to „to samo” co starsze kohorty odniesienia. Znaczy to, że DMP wygląda na kohortę, którą da się połączyć mostem na tyle dobrze, żeby weszła do warstwy dowodów: po kalibracji i z jasno opisanymi zastrzeżeniami.

Dlaczego to ważne

To krok metodologiczny, który zamienia wąską zweryfikowaną warstwę odniesienia w początek szerszego programu badawczego.

Z DMP i EstMB przyporządkowany panel staje się dużo bogatszy, zwłaszcza w obszarach, których wcześniejsze kohorty 16S prawie nie obejmowały. Najlepszy przykład to sygnały związane z lekami. Rozszerzony panel zawiera teraz znacznie więcej uporządkowanych dowodów dotyczących inhibitorów pompy protonowej, metforminy, statyn i podobnych czynników klinicznych, niż sama pierwotna warstwa z trzech kohort mogłaby udźwignąć.

Druga praca nie opowiada jednak historii „więcej danych, więc lepiej”. Opowiada o włączaniu danych w klasach pewności.

Jedne kohorty da się połączyć mocnym mostem. Inne można uwzględnić tylko warunkowo. A niektóre rodziny metod zostaną całkiem poza tym mostem, dopóki nie powstaną inne ramy.

To rozróżnienie ma znaczenie, jeśli chcesz opierać się na literaturze i nie obiecywać więcej, niż naprawdę zweryfikowano.

Słabszy most też coś mówi

Druga nowa kohorta, EstMB, jest ważna z innego powodu.

Nie ma związku z LifeLines, więc pokazuje, czy pomysł mostu działa także poza szczególnie korzystnym układem DMP. Na razie odpowiedź brzmi: tylko częściowo. EstMB daje wstępne oszacowanie skali 0,083, ale opiera się ono tylko na jednej binarnej parze zakotwiczenia.

EstMB nie może więc uchodzić za most równie pewny jak DMP.

To nie porażka. Właśnie takie wyniki powinien pokazywać program badawczy budowany etapami. Wątły most trzeba dalej traktować jak wątły i nie dorabiać mu pewności, której nie ma.

Jeden z głównych wniosków: rozszerzanie wyprzedza walidację

Jeden z najważniejszych wyników drugiej pracy dotyczy pojęć, a nie liczb.

W miarę jak panel rośnie, liczba przyporządkowanych sygnałów rośnie szybciej niż bezpośrednio zweryfikowana część wspólna. DMP wnosi setki istotnych związków, ale tylko znacznie mniejszy ich podzbiór mieści się w podwójnie istotnej przestrzeni mostu, potrzebnej do porównań na poziomie kalibracji. W EstMB ta część jest jeszcze mniejsza.

Ta asymetria nie jest drobną niedogodnością na obrzeżach analizy. To podstawowy fakt, który musi kształtować dalsze budowanie modeli.

Każda poważna warstwa łączenia danych zbudowana na publicznych wynikach o mikrobiomie powinna odróżniać:

• dowody połączone mocnym mostem
• dowody połączone częściowo
• dowody przyporządkowane, ale jeszcze niezweryfikowane

Co to oznacza dla Gut Twin

Dla Gut Twin (trzewnego bliźniaka) ta praca to drugi krok w większym projekcie.

Pierwsza praca pokazała, że ponowne wykorzystanie współczynników jest możliwe w wąskiej, zgodnej grupie badań. Druga pyta, czy da się je przenieść przez ważną granicę między metodami.

Odpowiedź jest zachęcająca, ale warunkowa:

• niektóre nowoczesne kohorty oparte na CLR wyglądają na takie, które da się połączyć mostem
• mocniejsze mosty zasługują na większą wagę w dalszych modelach
• słabsze mosty powinny dostawać mniejszą wagę
• i nie każda opublikowana rodzina metod pasuje do tej samej zintegrowanej warstwy

Takiego standardu chcemy się trzymać w tym projekcie. Nie wszystkie dowody liczą się tak samo. Każda kohorta musi zapracować na swoje miejsce porównywalnością, walidacją i jawnym określeniem pewności.

Co udostępniamy

Udostępniamy metadane harmonizacji, podsumowania obliczeń punktów zakotwiczenia, wyniki zgodności i metadane zasięgu potrzebne do prześledzenia logiki mostu.

Nie udostępniamy zintegrowanych tabel współczynników gotowych do użycia w modelu ani zbudowanego na nich systemu ważenia. To nadal zastrzeżone elementy szerszej infrastruktury Gut Twin.

Na jakim etapie jest ta seria

Dwie pierwsze prace opisują razem bardziej rygorystyczny sposób opierania się na publicznych dowodach o mikrobiomie.

Pierwsza praca ustaliła wąską, zweryfikowaną warstwę odniesienia. Druga pokazuje, jak wybrane nowsze kohorty można połączyć z tą warstwą przez empiryczną kalibrację zamiast naiwnego wrzucania wszystkiego do jednego worka.

Spora część literatury wciąż zostaje poza mostem. Niektóre przyszłe kohorty mogą wymagać zupełnie innej logiki kalibracji. Uważamy jednak, że to właściwa kolejność:

najpierw walidacja, potem most, potem integracja, a dopiero na końcu zaufanie do szerszej warstwy dowodów na tyle, żeby jej dalej używać.

Marvin Uhlmann i Maria Otworowska Gut Twin Research, Bliss Labs OÜ

Pełna praca techniczna, po angielsku: „Anchor calibration for extending diet-microbiome coefficient harmonization beyond 16S/MaAsLin cohorts.”